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    單克隆抗體多個關鍵質量屬性的評估 和可比(恒溫恒濕高低溫試驗箱)

    2021-12-10 19:12:12 廢氣處理設備 瀏覽數:3257
    在進行變性和二硫鍵還原后,加入133mmol/L碘乙酰胺(室溫下40分鐘)對游離的半胱氨酸進行烷基化。VOC接下來,使用RP-W小柱對樣品進行蛋白質純化應用,并在37°C下進行胰蛋白酶過夜酶解(蛋白質與蛋白酶比例20:1,w:w)。恒溫恒濕高低溫試驗箱使用C18反相柱執行AssayMAPBravo肽段純化方案(脫鹽)。結果與討論C端賴氨酸截短由于羧肽酶的活性,重鏈C端賴氨酸的截短是常見的PTM。通過陽離子交換色譜(CEX)可以很好地分離C端賴氨酸異構體(含賴氨酸和不含賴氨酸)。圖?1A顯示了使用AgilentBioMAbPEEK色譜柱分析mAb1獲得的電荷異構體圖譜的高分離度分離和三個不同的峰。13.11分鐘處的峰記為主峰(M)。

    摘要:基于多屬性方法 (MAM) 的 LC/MS 肽譜分析在生物制藥分析領域受到了廣泛的關 注。本應用簡報展示了使用 LC/MS 肽譜分析方法對不同單克隆抗體 (mAb) 的關鍵質 量屬性 (CQAs) 進行的表征和定量分析。將肽譜分析結果與傳統方法進行了比較,結 果表明,肽譜分析與傳統方法對賴氨酸截短、氧化、脫酰氨基化、N 端環化和糖基 化程度的估算高度相似


    前言:單克隆抗體 (mAbs) 來自正處于快速生長 期的生命系統。由于其生物來源,這些復 雜分子在生產過程中會經歷各種翻譯后 修飾 (PTMs),從而導致明顯的異質性。 在 mAbs 的開發和生產過程中,將這些 意外修飾作為 CQAs 進行表征和監測至關 重要。由于每種 CQA 的化學性質不同, 傳統上有幾種檢測方法可執行此分析,每 種技術都有各自的優缺點。近年來,基于 LC/MS 的多屬性方法 (MAM)[1] 獲得了廣 泛的應用,因為它有望提供一種對 mAb CQAs 進行全面表征的單一方法,與傳統 方法相比,該方法可有效節省分析時間和 成本。然而,在將 MAM 方法應用于嚴格 監管的質量控制環境之前,必須先驗證傳 統分析方法與肽譜分析結果的對應準確 性。重要的是確保肽譜分析工作流程可提 供與傳統分析方法相當的結果。本研究比較了肽譜分析方法與傳統分析 方法(包括離子交換色譜法、親水相互 作用色譜法 (HILIC) 和亞基水平反相色譜 法)的性能。使用由 Agilent?AssayMAP Bravo 液體處理平臺、Agilent? 1290 Infinity II 液相色譜系統和 Agilent?6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF,以及用于數據分 析的 Agilent?MassHunter BioConfirm 軟件 組成的一體化工作流程對 mAbs 進行了肽 譜分析。比較了肽譜分析方法與傳統分析 方法對各 CQA 的相對 (%) 定量結果。


    實驗部分:材料 mAb1、mAb2 和 mAb3 購自當地經銷商 (新加坡),并根據制造商的使用說明進 行儲存。三羥甲基氨基甲烷、Tris-HCl、 鹽酸胍、三(2-羧乙基)膦 (TCEP)、碘乙 酰胺 (IAA)、甲酸、三氟yi酸、磷酸二氫 鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉和 LC/MS 級溶 劑購自 Sigma-Aldrich。IdeS 蛋白酶購自 Genovis。高品質測序級胰蛋白酶來自安 捷倫科技公司。


    實驗方法 電荷異構體:將樣品直接進樣,無需稀釋 (10?mg/mL)。表 1 和表 2 列出了 mAb1 和 mAb2 針對弱陽離子交換 (WCX) 色譜 法的色譜參數。對收集的 WCX 餾分進行 了胰蛋白酶酶解和肽譜分析。 氧化:將 5 μL mAb 樣品(2 mg/mL,溶于 Tris-HCl 緩沖溶液)加入 5 μL IdeS 蛋白酶 中,30 °C 下孵育 30?分鐘,冷卻至室溫 后進行分析。 游離多聚糖:使用 AssayMAP Bravo 液體 處理系統和 GlykoPrep 快速 N-糖試劑盒 (GPPNG-PC) 進行標記 N-糖樣品前處理[2]。 通過 HILIC 實現標記 N-糖的分離。 胰蛋白酶酶解 將收集的 WCX 樣品和 mAb 樣品餾分還 原/烷基化,并用胰蛋白酶酶解,然后 使用 Agilent?AssayMAP Bravo 液體處理 平臺對其進行脫鹽處理[3]。恒溫恒濕高低溫試驗箱簡而言之, 將含有 mAbs 的樣品板復溶于變性緩沖 液(含 5 mmol/L TCEP 和 150 mmol/L Tris 的 8?mol/L 鹽酸胍,pH 8)中,并 在 60?°C 下溫育 60 分鐘。然后將樣品酸化并用 1.75% TFA 進行稀釋。

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    恒溫恒濕高低溫試驗箱隨后,通過 AssayMAP 試劑轉移工具使用 0.1% 甲 酸對樣品進行酸化,以終止胰蛋白酶的 活性。

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    賴氨酸殘基的丟失 會減少 mAbs 的凈正電荷,從而導致電 荷異質性。恒溫恒濕高低溫試驗箱早洗脫和晚洗脫峰分別稱為酸性 異構體(A1 和 A2)和堿性異構體(B1、 B2、B3、B4、B5 和 B6)。圖?1A 的表格 列出了主峰、酸性電荷異構體和堿性電荷 異構體的峰面積百分比。在通過 LC/MS 肽譜分析表征 C 端賴氨酸截短之前,將 電荷異構體峰收集作為單個餾分,并將 多次進樣的結果進行合并。恒溫恒濕高低溫試驗箱基于肽譜分 析,使用 C 端賴氨酸截短異構體對 CEX 峰進行標注。

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    通過羧肽酶 B (CPB) 處理, 進一步證實了 C 端賴氨酸的異質性。由 電荷異構體峰的面積百分比計算得到的 C 端賴氨酸截短的相對含量為 58.28%


    在基于肽譜分析的 C 端賴氨酸異構體圖 譜定量中,對 mAb1 進行了 LC/MS 肽譜 分析。恒溫恒濕高低溫試驗箱圖?1B 所示為 mAb1 的 LC/MS 肽 譜分析結果。MS/MS 分析確認了修飾和 未修飾重鏈 C 端賴氨酸截短肽的歸屬, 并鑒定得到其相對含量為 55.30%。 表?3 所示為傳統 CEX 和肽譜分析方法用 于 C 端賴氨酸截短異構體定量的比較。恒溫恒濕高低溫試驗箱 兩種方法估算的 C 端賴氨酸截短的相對 含量相當。

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